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肺炎双球菌转化实验的启示(转载)  

2009-11-16 13:07:32|  分类: 资料收藏 |  标签: |举报 |字号 订阅

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肺炎双球菌转化实验的启示(科学史资料)  
江游提供,ssw 发表于 2007-11-26 20:41:00
    发现DNA的遗传功能,始于1928年格里菲斯(F.Griffith)所做的用肺炎双球菌感染小家鼠的实验。
    肺炎双球菌基本上可以分为两个类型或品系。一个是有毒的光滑类型,简称为S型。一个是无毒的粗糙类型,简称为R型。S型的细胞由相当发达的荚膜(或称为被囊)包裹着。荚膜由多糖构成,其作用是保护细菌不受被感染的动物的正常抵抗机制所杀死,从而使人或小家鼠致病(对人,它能导致肺炎;对小家鼠,则导致败血症)。但在加热到致死程度后,该类型的细菌便失去致病能力。由于荚膜多糖的血清学特性不同、化学结构各异,S型又可分成许多不同的小类型,如SⅠ、SⅡ、SⅢ等。而R型细胞没有合成荚膜的能力,所以不能使人或小家鼠致病。它不能合成荚膜的原因在于一个控制UDPG一脱氢酶的基因发生了突变,R,S两型可以相互转化。1928年,格里菲斯将肺炎球菌SⅡ在特殊条件下进行离体培养,从中分离出R型。当他把这种R型的少量活细菌和大量已被杀死的SⅢ混合注射到小家鼠体内以后,出乎意外,小家鼠却被致死了。剖检发现,小家鼠的心血中有SⅢ细菌。这一实验结果可以有三种解释。(1)SⅢ细菌可能并未完全杀死。但这种解释不能成立,因为单独注射经过处理的SⅢ时并不能致死小家鼠。(2)R型已转变为S型。这一点也不能成立,因为剖检发现的是SⅢ不是SⅡ,R型从SⅡ突变而来,理应转化为 SⅡ。(3)R型从杀死的SⅢ获得某种物质,导致类型转化,从而恢复了原先因基因突变而丧失的合成荚膜的能力。格里菲斯肯定了这种解释。这就是最早发现的转化现象。
    三年之后,研究者们发现,在有加热杀死的S型细菌存在的条件下,体外培养R型的培养物,也可以产生这种转化作用。此后不到两年,又发现S型细菌的无细胞抽提物加到生长着的R型培养物上,也能产生R向S的转化(R→S)。于是,研究者们提出,加热杀死的S型细菌培养物或其无细胞抽提物中,一定存在着某种导致细菌类型发生转化的物质。这种物质究竟是什么,人们尚不知道,为便于研究,暂时叫做“转化因子”(transforming principle)。格里菲斯发现转化作用,为尔后认识到DNA是遗传物质奠定了基础。艾弗里和他的同事麦克劳德(C.M.Mcleod)和麦卡蒂(M.J.Mccarty)正是在这个基础上继续前进,才获得了重大的突破。1944年,在纽约洛克菲勒研究所,艾弗里等人为了弄清转化因子的化学本质,开始对含有R→S转化因子的SⅢ型细菌的无细胞抽提物进行分馏、纯化工作。他们根据染色体物质的绝大部分是蛋白质的事实,曾一度推断蛋白质很可能是“转化因子”。然而,当他们使用一系列的化学法和酶催化法,把各种蛋白质、类脂、多糖和核糖核酸从抽提物中去掉之后,却发现抽提物的剩余物质仍然保持把R型转化为S型的能力。于是,他们对自己的推断动摇了。最后,在对抽提物进一步纯化之后,他们发现,只消把取自SⅢ细胞抽提物的纯化DNA,以低达六亿分之一的剂量加在一个R型细胞的培养物中,仍然具有使R→SⅢ的转化能力。他们还发现,从一个本身由R型转化产生的S型细菌的培养物中提取的DNA也能使R→S。于是,他们得出结论说,“转化因子”就是DNA。并在《实验医学杂志》第79卷第137期发表了这一研究成果。
    艾弗里等人的试验和结论是对脱氧核糖核酸认识史上的一次重大突破,彻底改变了它在生物体内无足轻重的传统观念。艾弗里等人在1944年所作的试验和结论,不仅没有使科学界立即接受DNA是遗传物质的正确观念,反而引起了科学界许多人的极大惊讶和怀疑。当时主要有两种代表性的否定意见。第一种是,即使活性转化因子就是DNA,也可能只是通过对荚膜的形成有直接的化学效应而发生的作用,不是由于它是遗传信息的载体而起作用的。第二种否定意见则根本不承认DNA是遗传物质,认为不论纯化的 DNA从数据上看是如何的纯净,它仍然可能藏留着一丝有沾污性的蛋白质残余,说不定这就是有活性的转化因子。
    科学界的怀疑、否定,不但没有能动摇艾弗里等人继续探索的坚定信心,反而加强了他们的信念,为进一步明确、探索而奋斗。为了回答第一种怀疑论,泰勒(H.Taylor)和哈赤基斯(R.D.Hotchkiss)先后做了大量的实验工作。特别是他们在1949年所进行的实验,给了怀疑论者以致命一击。泰勒从粗糙型(即R突变型)品系中分离出一个新的更加粗糙、更加不规则的突变型ER,并且发现从R品系细胞中提取出来的DNA可以完成ER向R的转化。这样,就证明了在以往实验中作为受体的R品系本身还带有一种转化因子。这种转化因子能把R品系仍然还具有的一点点残余的合成荚膜的能力转授给那个荚膜缺陷更甚的ER品系。不仅如此,泰勒还发现,将从S品系(作为给体)提取的DNA加到ER品系(作为受体)中,也能实现ER向R的转化。如果把这种第一轮的R转化物抽取一些加以培养,然后再加进S给体的DNA,便会出现R向S的转化。泰勒的这些发现使得那些曾抱有“DNA仅仅是在多糖荚膜合成中作为一种外源化学介质进行干扰而导致转化作用”这种信念的人们,无言以对,只得认输。
   在同一年内,哈赤基斯还证实了那些与荚膜形成毫无关系的一些细菌性状(如对药物的敏感性和抗性)也会发生转化。他从正常的S型肺炎球菌中分离出了一种抗青霉素的突变型(记为PenrS),提取出它的DNA,加到一个由对青霉素敏感的S型中突变产生的R型(记为PenrR)的培养物中。结果发现,某些个Penr—R受体细菌已被转化为Penr—S给体型。据此,他得出结论说,肺炎球菌的DNA不但带有为荚膜形成所需要的信息,而且还带有对青霉素产生抗性的细胞结构的形成所需要的信息。他还认为,荚膜的形成和对青霉素的抗性似乎是由不同的DNA分子控制着。此后不久,哈赤基斯又利用从S野生型抗链霉素突变型细胞中提取的DNA进行试验,也获得了同上述实验完全相仿的结果。当哈赤基斯将其实验结果在美国科学院院报上发表之后,一切认为 DNA的转化作用是生理性的而不是遗传性的各种奇谈怪论便消失无踪了。
   针对第二种否定意见,艾弗里和麦卡蒂于1946年用蛋白水解酶、核糖核酸酶和DNA酶分别处理肺炎球菌的细胞抽提物。结果表明,前两种酶根本不影响抽提物的生物学效能,然而只消碰一碰后者,抽提物的转化活性便立即被完全破坏掉。这一结果进一步证明了DNA作为遗传信息载体的功能。哈赤基斯继续对转化因子进行化学提纯。到1949年时,他已经能把附着在活性DNA上的蛋白质含量降低到0.02%。尽管如此,在1949年,这些实验结果仍然没能使怀疑论者相信DNA是遗传变化的原因所在。甚至到1950年,米尔斯基(A.E.Mirsky)仍对艾弗里的转化因子试验结论持怀疑态度。他认为,“很可能就是DNA而不是其它的东西是对转化活性有责的,但还没有得到证实。在活性因子的纯化过程中,越来越多的附着在DNA上的蛋白质被去掉了,……但很难消除这样的可能性,即可能还有微量的蛋白质附着在DNA上,虽然无法通过所采用的各种检验法把它们侦察出来,……因此对DNA本身是否就是转化介质还存在一些疑问”。
   后来,随着对DNA化学本性的足够了解,特别是1952年赫尔希(A.D.Hers-hey)和蔡斯(M.Chase)证明了噬菌体DNA能携带母体病毒的遗传信息到后代中去以后,科学界才终于接受了DNA是遗传信息载体的理论。美国分子遗传学家G.S.斯坦特写道:“这项理论到1950年后好像突然出现在空中似的,到了1952年已被许多分子遗传学家奉为信条”。
   科学界对艾弗里等人的理论的怀疑,也反映到诺贝尔奖评选委员会中。当艾弗里提出他们的理论以后,闸有人提议艾弗里应获这种最高奖励。但鉴于科学界对其理论还抱有怀疑,诺贝尔奖评选委员会认为推迟发奖更为合适。可是,当对他的成就的争议平息、诺贝尔奖评选委员会准备授奖之时,他已经去世了。诺贝尔奖评选委员会只好惋惜地承认:“艾弗里于1944年关于DNA携带信息的发现代表了遗传学领域中一个最重要的成就,他没能得到诺贝尔奖金是很遗憾的”。  
   艾弗里等人的科学发现为什么迟迟得不到科学界的承认呢?这当然不是由于他们的不术地位低下所致,因为艾弗里那时已经是细菌学界的一员老将。不是由于出版机构的压抑,因为他的文章在《实验医学杂志》上得到了及时发表。也不是由于他们的研究超越了时代或离开了研究的主流趋势,因为当时有许多人都在研究格里菲斯发现的新现象。马克思主义认为,艾弗里的发现的蒙难主要由于认识论方面的一些原因造成的。具体说来是:第一,传统观念的束缚。无庸否认,大家早就怀疑过DNA在遗传过程中是否有一定的功能,特别是自从福尔根(F.Feulgen)于1924年证明了DNA是染色体的一个主要组分之后。但是,由于科学研究发展的特定历史进程,人们对蛋白质的研究更为充分,对它的重要性和分子结构的认识比较深入;而对DNA的研究就非常不够,因而人们也就很难设想DNA能够作为遗传信息的载体。在一段相当长的时间仙,DNA不像蛋白质那样引人注意。这除了它不像蛋白质(特别是酶)那样到处都是,且到处都是活跃以外,重要的一点还在于结构上似乎没有蛋白质那样变化多端,具有个性(同一生物体中的异源蛋白质之间,或者不同生物体中的同源蛋白质之间,在结构的特异性上存在着极大的差异)。直到30年代后期,科学界还普遍坚持莱文(P.A.T.Levine)在20年代提出的“DNA结构的四核苷酸假说”,认为DNA只不过是一种含有腺苷酸、鸟苷酸、胸腺苷酸和胞苷酸四种残基各一个的四核苷酸而已。到了40年代早期,尽管已经认识到DNA分子量实际上要比四核苷酸理论所要求的大得多,但是仍然普遍地相信四核苷酸乃是那较大的DNA聚合体的基本重复单元,其中四个嘌呤和嘧啶碱基都依次按规定的序列而被重复着。DNA被看成如同淀粉等聚合物一样的一种单调的均匀。
   第二,错误地总结经验造成的因噎废食。就在艾弗里等人做出上述结论的20年之间,著名生物学家、1915年诺贝尔化学奖获得者威尔斯塔特在实验中由于采用的酶溶液过于稀释之故,以至用通常的化学检验法显示不出它的蛋白质含量,但仍存在催化活性,于是便做出了酶不是蛋白质的错误结论,宣称已经制成了不含蛋白质的酶的制备物。由于这种结论出自权威之口,人们信以为真,结果使对酶的研究推迟达10年之久。1944年时,科学界对这种前车之鉴仍记忆犹新。所以,当艾弗里等人公布他们的结论后,害怕再受骗的科学界便不敢再盲然唯这位权威而是从,迟迟不予认可了。播种苦果的是已故权威威尔斯塔特,而蒙受苦果之害的是在世权威艾弗里。殊途而同归。“威尔斯塔特的错误幽灵使基因的研究又拖迟10年之久”。艾弗里等人及其科学发现的不幸遭遇,向我们提出了许多值得深思的问题。首先,作为一个科学工作者,我们应当努力克服思想上的保守性和片面性,做到不为流行观念所束缚,努力去揭示未曾为大多数人所注目的新领域;做到正确总结经验教训,不能因噎废食。其次,作为一个科研管理工作者,我们不仅应对那些成果在短期内就得到证实的发现者给予奖励,而且也应对那些其成果需要很长时间才能得到证实的卓越发现者(特别是其中的高龄科学家),及时给予承认。
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